На каких свойствах белков основан метод аффинной хроматографии
Аффинная хроматография — это разновидность адсорбционной хроматографии. Основной особенностью аффинной хроматографии является наличие комплементарности между иммобилизованным на матрице лигандом и вторым партнером пары взаимодействующих компонентов, который извлекается из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами. Использование высокоизбирательного взаимодействия позволяет за одну стадию достичь очень высокой степени очистки искомого вещества. Аффинное взаимодействие является нековалентным и может быть ослаблено путем изменения рН, ионной силы раствора, введения в раствор веществ, препятствующих образованию комплементарных связей. Важными преимуществами аффинной хроматографии являются: высокая избирательность, эффект концентрирования искомого вещества на аффинной матрице и освобождение от гидролитических ферментов. Аффинная очистка часто позволяет сохранить нативную структуру вещества.Чаще всего лиганд иммобилизуют на матрице ковалентно. Для закрепления лиганда матрица должна быть предварительно активирована, то есть на поверхности частиц носителя должны быть созданы реакционноспособные группы. Наиболее распространенный способ активации — создание на поверхности матрицы электрофильных групп, способных к взаимодействию с нуклеофильными группами лиганда. При этом процесс иммобилизации лиганда сводится к его инкубации с активированной матрицей. Следует отметить, что скорость протекания реакции сильно зависит от pH среды. В иммунохимии применяют как иммобилизацию антигена на матрице, так и присоединение к матрице антител. Разновидность аффинной хроматографии, в которой в качестве иммобилизованного лиганда используются антитела, носит название иммуноаффинной хроматографии.
Одним из наиболее распространенных носителей, используемых в биохимии уже на протяжении нескольких десятилетий, является сефароза — специальным образом обработанные сферические гранулы агарозы. Известно несколько способов активации сефарозы, однако чаще других применяют метод активации сефарозы с использованием бромциана (BrCN). Преимуществом данного метода является простота, высокая устойчивость образующихся связей, стабильность сефарозы в довольно широком диапазоне рН (от 2,0 до 12,0). Относительная жесткость и крупные размеры частиц сефарозы позволяют использовать такие носители в колоночной хроматографии при достаточно высоких скоростях подачи растворов на колонку.
Активацию сефарозы осуществляют в процессе инкубации раствора бромциана с водной суспензией сефарозы. Бромциан взаимодействует с гидроксильными группами сефарозы, в результате чего образуется имидокарбонат, содержащий электрофильный атом углерода. Помимо этого в ходе реакции образуется неактивный карбамат, не способный к реакции с нуклеофильными боковыми группами аминокислот. При взаимодействии имидокарбоната с нуклеофильными группами, прежде всего с e-аминогруппами лизина, происходит образование прочной ковалентной связи белка с активированной матрицей через остаток изомочевины или N-замещенного карбамата (рис. 1). Реакция активации матрицы бромцианом проходит только в щелочной среде с выделением бромистоводородной кислоты, для нейтрализации которой требуется постоянное добавление щелочи к реакционной смеси. Реакция бромциана с гидроксилами матрицы экзотермична, поэтому ее проводят на ледяной бане.
Рис. 1. Схема иммобилизации белка на BrCN-активированной сефарозе
Нужно заметить, что активными нуклеофилами, кроме e-аминогрупп лизина, являются также SH-группа цистеина, концевые аминогруппы белков и ОН-группа тирозина (по активности данные группы располагаются в следующем порядке: SH- ˃ концевая NH2- ˃ OH-группа тирозина). С другой стороны, тиоэфиры менее прочны, чем кислородные эфиры, а последние уступают по прочности амидным связям.
В иммунохимических исследованиях с использованием BrCN-активированной сефарозы готовят два типа носителей — носители с иммобилизованными антигенами и носители с иммобилизованными антителами. Первые имеют ограниченное применение и используются, как правило, для выделения из сыворотки иммунного животного (содержащей антитела различной специфичности) пула антител, специфичных только к белку, иммобилизованному на носителе. Гораздо чаще на практике используют носители с иммобилизованными антителами. Основная область применения таких носителей — экстракция из грубой смеси макромолекул (как правило — белков). Высокая специфичность антител к антигену позволяет за короткий промежуток времени и в одну стадию получить высокоочищенный (с чистотой до 95-99%) препарат белка.
Рис. 2. Установка для колоночной иммуноаффинной хроматографии
Экстракцию исследуемого белка из смеси осуществляют двумя способами. Первый, используемый, как правило, для получения препаративных количеств белка, основан на применении метода колоночной иммуноаффинной хроматографии (Рис.2). В зависимости от поставленной задачи аффинным носителем заполняют колонки различного диаметра (от нескольких миллиметров до метра) и через эти колонки пропускают белковый раствор, содержащий исследуемый антиген. Большинство макромолекул проходит через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антителами, иммобилизованными на носителе, и антигеном, содержащимся в растворе, образуется иммунный комплекс (рис. 3). После отмывки носителя от не связавшихся белков иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 — pH 4,0) или высокими (pH 11,0 — pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемый белок элюируют с носителя, его собирают и переводят в оптимальный для хранения данного белка буфер.
Рис. 3. Схема хроматографии белков на аффинном носителе.
Второй способ экстракции исследуемого белка из сложной смеси — иммунопреципитация, или экстракция в объеме. Иммунопреципитацию используют при работе с незначительными (нано- и микрограммы) количествами вещества. При этом объем аффинного носителя обычно не превышает сотен микролитров, а объем исследуемого образца — нескольких миллилитров. То есть, иммунопреципитацию используют в тех ситуациях, когда из-за малого количества исследуемого вещества оказывается технически сложным создать адекватную по размерам аффинную колонку.
Рис. 4. Схема аффинного выделения белков методом иммунопреципитации.
При проведении иммунопреципитации образец, содержащий исследуемый белок, некоторое время инкубируют (при постоянном перемешивании) с частицами носителя. В процессе инкубации образуется иммунный комплекс, и исследуемый белок переходит из раствора на частицы носителя. После этого носитель осаждают, как правило, центрифугированием, супернатант отбрасывают, а иммунный комплекс, иммобилизованный на частицах носителя, разрушают добавлением тех же растворов, что и в случае с колоночной хроматографией (рис. 4). Также иммунный комплекс может быть разрушен ДСН-содержащим буфером, который используют для приготовления образца белка при проведении ДСН электрофореза. Такой буфер используют в том случае, если в дальнейшем планируют изучать экстрагированный белок с использованием метода электрофореза в денатурирующих условиях, или методом вестерн-блоттинг. Однако при использовании данного метода элюции белка следует учитывать, что повторное использование носителя становится невозможным из-за денатурации иммобилизованных антител. Кроме того, исследуемый образец помимо целевого белка будет содержать легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов.
Версия для печати
Источник
Изучение физико-химических свойств, химического состава и структуры возможно только при исследовании очищенного белкового препарата. Для выделения и фракционирования индивидуальных белков используются: высаливание, осаждение органическими растворителями, гельфильтрация, электрофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.
Высаливание белковосновано на зависимости растворимости белка от свойств среды. В дистиллированной воде протеины растворяются хуже, чем в слабых растворах солей, так как низкие концентрации ионов поддерживают их гидратные оболочки. Но при высоких концентрациях соли молекулы белка теряют гидратные оболочки, агрегируют и образуется осадок. После удаления соли белки вновь переходят в раствор, сохраняя нативные свойства и конформацию.
Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используется для выделения индивидуальных белков. Чаще всего для высаливания белков используют растворы сульфата аммония разной концентрации.
Осаждение белков из раствора без их денатурации осуществляют с помощью дегидрирующих агентов – органических растворителей (этанол, ацетон).
Гель-фильтрацияоснована на разделении белков по величине и форме молекулы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных гранулами пористого геля (сефадекса, агарозы), в буферном растворе с определенным значением рН. Гранулы геля проницаемы для белков благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром, размер которого зависит от типа геля (сефадекс G-25, G-200 и т.д.). Смесь белков вносят в колонку и затем вымывают (элюируют) буферным раствором с определенным значением рН. Крупные молекулы белка не проникают в поры геля и перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Мелкие молекулы низкомолекулярной примеси (соли) или другого белка удерживаются гранулами геля и вымываются из колонки медленнее (рис. 1.29). На выходе колонки раствор (элюат) собирают в виде отдельных фракций.
Рис. 1.29. Разделение белков методом гель-фильтрации
Электрофорезоснован на свойстве заряженных молекул белка перемещаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие при данном значении рН суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительный – к катоду. Электрофорез проводят на разных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. Скорость перемещения зависит от заряда, массы и формы молекул белка. После завершения электрофореза зоны белков на носителе окрашивают специальными красителями (рис. 1.30, А).
Разрешающая способность электрофореза в геле выше, чем на бумаге, так при электрофорезе белков сыворотки крови на бумаге выделяют 5 фракций (альбумины, α1-, α2-, β-, γ-глобулины), а в полиакриламидном геле – до 18 фракций (рис. 1.30, Б).
Рис. 1.30. Электрофореграмма белков сыворотки крови здорового человека
А– электрофореграмма белков сыворотки крови на бумаге;
Б– количество белков плазмы разных фракций.
I – γ-глобулины; II – β-глобулины; III – а2-глобулины;
IV – а1-глобулины; V – альбумины
Ионообменная хроматографияоснована на разделении белков, отличающихся суммарным зарядом. Раствор белка с определенным значением рН пропускают через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым сорбентом, при этом часть белков задерживается в результате электростатического взаимодействия. В качестве сорбента используют ионообменные вещества: анионообменники (содержащие катионные группы) для выделения кислых белков; катионообменники (содержащие анионные группы) для выделения основных белков.
При пропускании белка через колонку прочность его связывания с ионообменником зависит от величины заряда, противоположного заряду сорбента. Адсорбированные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферными растворами с различной концентрацией соли и рН, получая разные фракции белков.
Аффинная хроматографияоснована на специфичности связывания белка с лигандом, присоединенным к твердому носителю. В качестве лиганда используются субстраты ферментов, простетические группы холопротеинов, антигены и т.д. При пропускании через колонку смеси белков к лиганду присоединяется только комплементарный протеин (рис. 1.31, А), все остальные выходят вместе с раствором. Адсорбированный белок элюируется раствором с другим значением рН (рис. 1.31, Б). Этот метод высокоспецифичен и позволяет получать белковые препараты высокой степени очистки.
Выделение и очистка белка обычно проходят в несколько стадий с использованием различных методов. Последовательность стадий подбирается эмпирическим путем и может различаться для разных протеинов. Высокая степень очистки белков очень важна как при использовании их в качестве лекарственных препаратов (гормон инсулин и т.д.), так и при диагностике различных заболеваний по изменению белкового состава тканей, крови, слюны и др.
Набор белков в клетках различных органов взрослого человека индивидуален и поддерживается относительно постоянным на протяжении жизни. Специализированные ткани могут содержать специфические белки, например гемоглобин в эритроцитах, актин и миозин в мышцах, родопсин в сетчатке глаза, разные типы коллагена в костной и соединительной тканях. Некоторые белки содержатся во многих тканях, но в разных количествах. Отдельные изменения состава
Рис. 1.31. Разделение белков методом аффинной хроматографии
А– связывание выделяемого белка со специфическим лигандом, присоединенным к нейтральному носителю; Б– получение раствора индивидуального белка
белков тканей и крови возможны и связаны прежде всего с режимом питания, составом пищи, физической активностью человека.
При заболеваниях белковый состав крови и клеток тканей может существенно изменяться, часто развивается недостаточность какого-либо белка либо снижение его активности – протеинопатия.Поэтому определение выраженных изменений белкового состава крови и тканей используется для диагностики различных заболеваний в клинических исследованиях.
Источник
Хроматография – это один из методов разделения веществ. Она используется для последующего качественного и количественного анализа физических и химических свойств микрочастиц. Разновидностью данной технологии является аффинная хроматография. Идея дифференциации белковых соединений с использованием свойства сродства молекул известна в науке уже несколько десятилетий. Однако свое развитие она получила только в последние годы, после того, как были внедрены высокопористые гидрофильные материалы, использующиеся в качестве матрицы. Данный метод позволяет решать как аналитические задачи (разделение веществ и их идентификация), так и препаративные (очистка, концентрирование).
Сущность
Аффинная хроматография (от латинского слова affinis – «смежный», «родственный») основана на аффинных взаимодействиях, которые представляют собой образование высоко специфических связей между молекулой-разделителем (лигандом или аффинантом) и целевой молекулой. Эти механизмы широко распространены в природе (связь медиаторов или гормонов и рецепторов, антител и антигенов, гибридизация полинуклеотидов и другие виды процессов). В медицине аффинная хроматография начала применяться в практических целях начиная с 1951 г.
Разделение компонентов происходит следующим образом:
- рабочий раствор, содержащий вещество, которое необходимо выделить, пропускают через сорбент;
- лиганд, нанесенный на матрицу-сорбент, удерживает это вещество;
- происходит его концентрирование (накопление);
- извлечение выделенного вещества с сорбента при помощи вымывания растворителем.
Данный способ позволяет выделить целые клетки. Отличием от традиционной сорбционной хроматографии является то, что существует прочное биоспецифическое связывание выделяемого компонента с сорбентом, характеризующееся высокой избирательностью.
Адсорбенты
В качестве адсорбентов применяют следующие вещества:
- Гелеобразные составы на основе агарозы – полисахарида, получаемого из агара. Наиболее часто используют 3 разновидности: сефарозу 4 В, CL (сшитая агароза) и аффи-гель. Последний состав представляет собой модифицированный гель из агарозы и полиакриламида. Он обладает большей биологической инертностью, высокой химической и термической стойкостью.
- Кремнезем (силикагель).
- Стекло.
- Органические полимеры.
Для устранения механических препятствий при контакте лиганда применяют дополнительные вещества, отделяющие его от носителя (пептиды, диамины, полиамины, олигосахариды).
Аппаратура
Оборудование для аффинной хроматографии включает в свой состав следующие основные узлы:
- емкости-накопители для подвижной фазы (элюента);
- насосы высокого давления для подачи среды (чаще всего поршневые);
- фильтр для очистки элюентов от пыли;
- дозирующее устройство;
- хроматографическая колонна для разделения смеси;
- детектор для определения разделенных компонентов, выходящих из колонны;
- регистраторы хроматограмм и микропроцессорный блок (ЭВМ).
С целью уменьшения количества растворенного воздуха через подвижную фазу предварительно пропускают гелий. Для изменения концентрации элюента устанавливают несколько насосов, управляемых программатором. Хроматографические колонны изготавливаются из нержавеющей стали (при повышенных требованиях к коррозионной устойчивости), из стекла (универсальный вариант) или из акрила. Для препаративных целей их диаметр может колебаться от 2 до 70 см. В аналитической хроматографии применяют микроколонки Ø10-150 мкм.
Для повышения чувствительности детекторов в смесь вводятся реагенты, которые способствуют образованию веществ, которые больше поглощают лучи в ультрафиолетовой или видимой области спектра.
Методика проведения
Различают 2 основных вида жидкостной аффинной хроматографии:
- Колоночная, при которой колонну заполняют неподвижной фазой и через нее пропускают смесь с потоком элюента. Разделение может происходить под давлением или под в результате действия силы тяжести.
- Тонкослойная. Элюент движется по плоскому слою адсорбента под воздействием капиллярных сил. Адсорбент наносят на пластину из стекла, керамическую или кварцевую палочку, металлическую фольгу.
Основные этапы работ включают в себя:
- подготовка адсорбента, фиксация лиганда на носителе;
- подача смеси для разделения в хроматографическую колонну;
- загрузка подвижной фазы, связывание компонента лигандом;
- замена фазы для выделения связанного вещества.
Назначение
Аффинная хроматография используется для выделения следующих видов веществ (в скобках указан вид применяемого при этом лиганда):
- аналоги ферментативных ингибиторов, субстратов и кофакторов (ферменты);
- биоорганические вещества, обладающие признаками генетической чужеродности, вирусы и клетки (антитела);
- высокомолекулярные углеводы, полимеры моносахаридов, гликопротеины (лектины);
- ядерные белки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеиновые кислоты);
- рецепторы, транспортные белки (витамины, гормоны);
- белки, взаимодействующие с клеточными мембранами (клетки).
Эта технология также используется для получения иммобилизованных ферментов, а привязка их к целлюлозе позволяет изготовить иммуносорбенты.
Хроматография ДНК-связывающих белков
Выделение ДНК-связывающих белков производится с помощью гепарина. Этот гликозаминогликан способен связывать большой диапазон молекул. Аффинная хроматография белков данной группы используется для выделения таких веществ, как:
- факторы инициации и элонгации трансляции (синтез молекул нуклеиновых кислот и белков);
- рестриктазы (ферменты, узнающие определенные последовательности в двухцепочечной ДНК);
- ДНК-лигазы и полимеразы (ферменты, катализирующие соединение двух молекул с образованием новой химической связи и участвующие в репликации ДНК);
- ингибиторы сериновых протеаз, которые играют важную роль в иммунных и воспалительных процессах;
- факторы роста: фибробластов, Шванна, эндотелиальный;
- белки межклеточного матрикса;
- рецепторы гормонов;
- липопротеиды.
Достоинства
Данный метод является одним из самых специфических для выделения реакционноспособных соединений (ферментов и более крупных агрегатов – вирусов). Однако он используется не только для выделения биологически активных веществ.
Выявление антител в малых количествах, количественная оценка полиадениловой кислоты, экспресс-определение молекулярных масс дегидрогеназ, удаление определенных загрязнителей, изучение кинетики активации неактивной формы трипсина, молекулярного строения интерферонов человека – вот далеко не весь перечень исследований, при которых применяется аффинная хроматография. Применение в клинике обусловлено такими ее преимуществами, как:
- Возможность эффективной очистки белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот. Они незначительно отличаются по своим физико-химическим свойствам и теряют активность при гидролизе, денатурации и прочих видах воздействия, используемых в других методах.
- Быстрота разделения веществ, динамический характер процесса.
- Отсутствие необходимости в специальной очистке ферментов и гомогенизации изоферментов для определения констант диссоциации.
- Возможность разделения широкого круга веществ.
- Небольшой расход лигандов.
- Возможность разделения веществ в больших объемах.
- Обратимый процесс связывания биологических макромолекул.
Данную методику можно совмещать с другими, накладывать дополнительное поле (гравитационное, электромагнитное). Это позволяет расширить технические возможности хроматографии.
Ферментная инженерия
Благодаря этому методу началось активное развитие новой отрасли биотехнологий – ферментной инженерии.
Аффинная хроматография применительно к выделению ферментов обладает следующими преимуществами:
- получение ферментов в больших количествах в результате меньших затрат времени, как результат – их удешевление;
- иммобилизация ферментов позволяет значительно расширить область их применения в медицине и промышленности;
- связь ферментов с нерастворимой твердой подложкой дает возможность изучить влияние микроокружения и направление реакций, которые играют важную роль в природных и физиологических процессах.
Аффинная хроматография в медицине: особенности и применение — советы и рекомендации о здоровье на AllMedNews.ru
Источник