На каком свойстве белков основан метод электрофореза
Электрофорез
белков –
способ разделения смеси белков на
фракции или индивидуальные белки.
Электрофорез применяют как для анализа
компонентов смеси белков, так и для
получения гомогенного белка.Наиболее
распространенным вариантом
электрофоретического анализа белков,
является электрофорез белков в
полиакриламидном геле.
Метод
электрофореза основан
на различии в скорости движения (
подвижности ) белков в электрическом
поле, которая определяется величиной
заряда белка при определенных значениях
рН и ионной силы раствора. В последнее
время более широкое распространение
получили методы зонального электрофореза
белков на различных носителях, в частности
на твердых поддерживающих средах: гелях
крахмала и полиакриламида, целлюлозе.
Преимущества их по сравнению с методом
свободного электрофореза состоят в
том, что исключается размывание границы
белок-растворитель в результате диффузии
и конвекции, не требуется налаживания
сложной аппаратуры для определения
положения границы, а для анализа
необходимо небольшое количество белка.
Рис.
1. Электрофореграмма (А) и денситограмма
(Б) белков сыворотки крови.
Методом
электрофореза на ацетилцеллюлозе или
геле агарозы белки сыворотки крови
можно разделить на:
альбумины
(55-65%),α1-глобулины
(2- 4%),α2 -глобулины
(6-12%),β-глобулины
(8-12%),γ-глобулины
(12-22%).
52. Принципы энзимодиагностики.
Энзимодиагностика заключается
в постановке диагноза заболевания (или
синдрома) на основе определения активности
ферментов в биологических жидкостях.
Принципы
энзимодиагностикиоснованы
на следующих закономерностях:
в
норме в сыворотке крови содержатся
ферменты, выполняющие специализированные
функции, например, участвующие в
свертывающей системе крови. Клеточные
ферменты практически не проникают из
неповрежденных клеток в кровь. В
минимальных количествах некоторые
ферменты клеток могут определяться в
крови;
при повреждении мембран
клеток (воспаление, некроз) в крови или
других биологических жидкостях
(например, в моче) увеличивается
количество внутриклеточных ферментов
поврежденных клеток, активность которых
можно зарегистрировать специальными
биохимическими тестами;
для
энзимодиагностики используют ферменты,
имеющие преимущественную или абсолютную
локализацию в определенных
органах (органоспецифичность);
количество
высвобождаемого фермента должно быть
пропорционально степени повреждения
ткани и достаточно для определения его
активности;
активность
ферментов в биологических жидкостях,
обнаруживаемых при повреждении клеток,
отличается от нормальных значений и
стабильна в течение достаточно
длительного времени (сутки);
появление
в плазме крови ферментов, имеющих только
цитозольную локализацию, свидетельствует
о воспалительном процессе; при обнаружении
митохондриальных или ядерных ферментов
можно говорить о более глубоких
повреждениях клетки, например некрозе.
Соседние файлы в предмете Биохимия
- #
- #
- #
- #
Источник
Электрофорез белков сыворотки крови (протеинограмма) является лабораторным исследованием, позволяющим определить количественные и качественные изменения основных белковых фракций. Данное исследование позволяет выявить острые и хронические воспаления инфекционной и неинфекционной природы, онкологические (моноклональные гаммапатии) и многие другие патологии, а также контролировать их лечение.
Благодаря ультрасовременной аппаратуре Юсуповской больницы и огромному опыту наших высококвалифицированных диагностов, грамотно интерпретирующих результаты исследования, обеспечиваются максимально точные результаты анализа в короткие сроки. Комплексным обследованием занимается мультидисциплинарная команда врачей, которые, в целях уточнения диагноза, назначают электрофорез белков сыворотки крови и другие высокотехнологичные лабораторные и инструментальные исследования, позволяющие выявить патологию на ранних стадиях развития, благодаря чему каждому пациенту подбирается наиболее эффективная индивидуальная схема лечения.
Электрофорез белков сыворотки крови: общая информация
В состав общего белка сыворотки крови входят альбумины и глобулины, которые в норме находятся в определенных качественных и количественных соотношениях. Для оценки соотношения альбумина и глобулина в крови проводится электрофорез белков с применением агарозного геля.
Изменение качественного и количественного соотношения в протеинограмме может свидетельствовать о наличии в организме самых различных заболеваний (от вирусного гепатита до хронической сердечной недостаточности).
Для постановки точного диагноза, кроме результатов электрофореза белков крови, специалисты Юсуповской больницы назначают дополнительные клинические, лабораторные и инструментальные исследования.
Электрофорез белков сыворотки крови: цели исследования
Электрофорез белков крови позволяет точно оценить качественное и количественное соотношение основных белковых фракций у пациентов, страдающих следующими патологиями:
- острые и хронические инфекционные заболевания;
- заболевания печени (например, хронический вирусный гепатит);
- аутоиммунные состояния;
- почечные патологии (нефротический синдром);
- моноклональные гаммапатии (моноклональная гаммапатия неясного происхождения и множественная миелома);
- синдром иммунодефицита (агаммаглобулинемия Брутона).
Электрофорез белков сыворотки крови: показания
Электрофорез белков сыворотки крови является довольно информативным исследованием, которое назначается пациентам Юсуповской больницы при подозрении на следующие заболевания и состояния:
- острые и хронические инфекционные заболевания, определенные заболевания печени и почек, аутоиммунные состояния;
- немотивированная слабость, множественная миелома, персистирующая лихорадка, патологические переломы или боли в костях, рецидивирующие инфекционные заболевания;
- подозрение на недостаточный уровень альфа-1-антитрипсина, синдром Брутона и другие иммунодефицитные состояния;
- отклонения в других лабораторных исследованиях, которые могут свидетельствовать о множественной миеломе: гиперкальциемия, гипоальбуминемия, лейкопения, анемия.
Референсные значения белковых фракций сыворотки крови
Нормальными значениями общего белка у детей считаются 44-80 г/л, в зависимости от возраста ребенка, у взрослых людей – от 64 до 83 г/л.:
- альбумина – от 55,8 до 66,1 %;
- альфа-1-глобулина – от 2,9 до 4,9%;
- альфа-2-глобулина – от 7,1 до 11,8%;
- бета-1-глобулина – от 4,7 до 7,2%;
- бета-2-глобулина – от 3,2 до 6,5%;
- гамма-глобулина – от 11,1 до 18,8%.
Причины нарушения баланса белковых фракций в сыворотке крови
Изменение баланса тех или иных белковых фракций крови может сигнализировать о наличии в организме каких-либо патологических процессов.
Альбумин
Фракция альбумина может быть повышена при:
- дегидратации;
- алкоголизме;
- беременности.
Фракция альбумина понижается при:
- остром холецистите;
- воспалительных и опухолевых заболеваниях ЖКТ;
- лейкозе;
- язвенной болезни;
- острой ревматической лихорадке;
- нефротическом синдроме;
- макроглобулинемии;
- сахарном диабете;
- саркоидозе;
- множественной миеломе;
- пневмонии;
- хронической сердечной недостаточности;
- остеомиелите;
- неспецифическом язвенном колите;
- системной красной волчанке;
- лимфоме;
- приеме глюкокортикоидов.
Альфа-1-глобулин
Фракция альфа-1-глобулина повышается при:
- лимфогранулематозе;
- острых или хронических воспалительных заболеваниях;
- язвенной болезни;
- циррозе печени;
- стрессе;
- беременности;
- приеме гормональных контрацептивов.
Фракция альфа-1-глобулина понижается при:
- остром вирусном гепатите;
- недостаточности альфа-1-антитрипсина;
Альфа-2-глобулин
Фракция альфа-2-глобулина повышается при:
- хроническом гломерулонефрите;
- острой ревматической лихорадке;
- сахарном диабете;
- циррозе печени;
- саркоидозе;
- лимфогранулематозе;
- узловатом полиартериите;
- нефротическом синдроме;
- системной красной волчанке;
- остеомиелите;
- ревматоидном артрите;
- пневмонии;
- диспротеинемии;
- стрессе;
- язвенной болезни;
- пожилом и младенческом возрасте;
- мальабсорбции;
- неспецифическом язвенном колите.
Фракция альфа-2-глобулина понижается при:
- гипогаптоглобинемии;
- остром вирусном гепатите;
- гипертиреозе;
- интраваскулярном гемолизе;
- мальабсорбции.
Бета-глобулин
Фракция бета-глобулина повышается при:
- сахарном диабете;
- гломерулонефрите;
- острых воспалительных заболеваниях;
- гиперхолестеринемии;
- диспротеинемии;
- саркоидозе;
- макроглобулинемии;
- подпеченочная желтуха;
- железодефицитной анемии;
- нефротическом синдроме;
- ревматоидном артрите;
- беременности;
- приеме гормональных контрацептивов.
Фракция бета-глобулина понижается при:
- лейкозе;
- аутоиммунных заболеваниях;
- системной склеродермии;
- циррозе печени;
- лимфоме;
- нефротическом синдроме;
- системной красной волчанке;
- стеаторее;
- неспецифическом язвенном колите.
Гамма-глобулин
Фракция гамма-глобулина повышается при:
- циррозе печени;
- хроническом лимфолейкозе;
- амилоидозе;
- множественной миеломе;
- муковисцидозе;
- моноклональной гаммапатии неясного генеза;
- ювенильном ревматоидном артрите;
- синдроме Шегрена;
- системной склеродермии;
- системной красной волчанке;
- тиреоидите Хашимото;
- криоглобулинемии;
- саркоидозе;
- ревматоидном артрите;
- макроглобулинемии Вальденстрема.
Фракция гамма-глобулина понижается при:
- агаммаглобулинемии;
- остром вирусном гепатите;
- склеродермии;
- мальабсорбции;
- лейкозе;
- нефротическом синдроме;
- стеаторее;
- лимфоме;
- гломерулонефрите;
- неспецифическом язвенном колите.
Электрофорез белков сыворотки крови: подготовка к проведению исследования
За 12-15 часов до исследования рекомендуется отказаться от приема пищи.
Минимум за час-полтора до забора крови для анализа необходимо избегать физического и эмоционального перенапряжения, исключить курение.
Во избежание получения искаженных результатов не стоит проводить электрофорез белков сыворотки крови сразу после процедуры гемодиализа и процедур с использованием радиоконтрастных веществ. Необходимо также исключить прием пенициллина, который может привести к расщеплению полосы альбумина.
Электрофорез белков: где сделать?
Электрофорез белков сыворотки крови является важной частью комплексного обследования пациентов в Юсуповской больнице. Данное исследование назначается при подозрении на наличие в организме той или иной из вышеперечисленных патологий.
Узнать стоимость услуг лабораторной диагностики и записаться на проведение исследования можно по телефону или онлайн на сайте Юсуповской больницы.
Автор
Логопед-дефектолог, к.м.н.
Список литературы
- МКБ-10 (Международная классификация болезней)
- Юсуповская больница
- Бадалян Л. О. Невропатология. — М.: Просвещение, 1982. — С.307—308.
- Боголюбов, Медицинская реабилитация (руководство, в 3 томах). // Москва — Пермь. — 1998.
- Попов С. Н. Физическая реабилитация. 2005. — С.608.
Наши специалисты
Заведующий отделением восстановительной медицины, врач по лечебной физкультуре, невролог, рефлексотерапевт
Инструктор-методист по лечебной физкультуре, кинезитерапевт
Инструктор-методист по лечебной физкультуре
Логопед-дефектолог
Врач-невролог, к.м.н.
Врач-невролог, к.м.н.
Цены на услуги *
*Информация на сайте носит исключительно ознакомительный характер. Все материалы и цены, размещенные на сайте, не являются публичной офертой, определяемой положениями ст. 437 ГК РФ. Для получения точной информации обратитесь к сотрудникам клиники или посетите нашу клинику.
Скачать прайс на услуги
Мы работаем круглосуточно
Источник
Одним из видов анализа крови является электрофорез ее белков. Такое исследование направлено на выявление парапротеинов. Оно проводится по медицинским показаниям. Данный анализ относится к лабораторным методам. Он позволяет с высокой эффективностью выявлять изменения, которые происходят при воспалениях, протекающих остро или хронически инфекционной и не инфекционной природы, и состояниях связанных с развитием онкологических заболеваниях. Применяется анализ и для контроля эффективности лечения.
Что такое электрофорез белков: суть метода
Метод разделения белков на фракции — электрофорез
Этот анализ является исследованием, которое позволяет определить их количественные и качественные показатели по тому, как белки распределяются в электрическом поле. Исследование основано на том, что белковые молекулы несут заряды, положительные или отрицательные в зависимости от того, какой кислотностью будет обладать среда, в которой будет проводиться непосредственно электрофорез. Молекулы, которые окажутся положительно заряженными, будут адсорбироваться лучше, нежели чем те, которые несут отрицательный заряд.
Носителями, которые будут применяться для электрофореза, могут быть хроматографическая бумага, агаровый гель, полиакриловой гель, ацетатцеллюлозная бумага или акриловый гель. Значительно реже применяется капиллярный электрофорез.
Какие фракции белков существуют
Во время анализа белки разделяют на 5 или 6 фракций, в зависимости от применяемого метода. Это будут гамма-глобулины, которые делятся на бета-1 и бета-2, альбумины — альфа-1 и альфа-2, а также бета-глобулины.
Норма белковых фракций
Метод помогает фиксировать отклонения белков по фракциям
Имеются установленные нормы белковых фракций, которые должны присутствовать в крови. Отклонение их от показателей является признаком нарушения в организме, что требует проведения обследования для выявления причины.
| Фракция | Норма в г/л |
|---|---|
| Альбумин | 35-44 |
| Глобулин альфа-1 | 1-3 |
| Глобулин альфа-2 | 5-8 |
| Бета-глобулин | 4-10 |
| Гамма-глобулин | 5-12 |
Значения показателей, в зависимости от того какие реактивы применяются в конкретной лаборатории, могут несколько изменяться. Поэтому в бланке результатов исследования в каждом медицинском учреждении обязательно указываются значения нормы, которые приняты в нем. На них будет ориентироваться врач при расшифровке анализа.
Показания и подготовка к тесту
Аутоиммунная патология почек — показание к анализу
Электрофорез белков крови назначают не очень часто, так как сегодня современные лабораторные исследования позволяют провести анализ на определенный белок, что ускоряет процесс диагностики. Абсолютным показанием к электрофорезу является наличие монолокальной гаммапатии. Также иногда анализ может быть показан в таких случаях:
- чрезмерно высокая скорость оседания эритроцитов, когда она превышает 50 мм/ч;
- значительно повышенный уровень гамма-глобулинов;
- скрининговое обследование для контроля эффективности лечения миеломной болезни;
- чрезмерно высокий общий белок в крови;
- ряд аутоиммунных заболеваний, поражающих печень и почки;
- слабость, для которой нет выраженной причины;
- развитие патологических переломов костей и постоянные боли в костях;
- частые рецидивы инфекционных заболеваний;
- нарушения, обнаруженные в прочих анализах, указывающие на то, что у человека могут развиваться анемии, лейкемии, гиперкальциемия или гипоальбуминемия.
При общей диспансеризации и получении медицинских справок для трудоустройства данное исследование крови не осуществляется. Не требуется оно и в процессе подготовки человека к хирургическому вмешательству.
Для получения наиболее точных результатов рекомендуется соблюдение правил подготовки к анализу. Они включают в себя голодную диету в течение 15 часов до того как будет взята кровь, когда пациент может употреблять только чистую не газированную воду. За 90 минут до проведения исследования необходимо полностью исключить нагрузки как эмоциональные, так и физические, и курение в активной или пассивной форме. Чтобы не допустить искажение данных, забор материала не проводят сразу после того, как был осуществлен гемодиализ или проведена процедура, при которой использовались радиоконтрастные составы. Важно также, чтобы за несколько дней до исследования полностью было исключено лечение пенициллином, так как он вызывает расщепление амбулина, что исказит результат.
Расшифровка результатов: повышенное и пониженное значение
| Фракция | Повышение | Понижение |
|---|---|---|
| Амбулин | Злоупотребление алкоголем, период вынашивания ребёнка, дегидрация | Холецистит в острой форме, лейкоз, миелома, саркоидоз, пневмония, остеомиелит, системная красная волчанка, лимфома |
| Глобулин альфа-1 | Цирроз печени, стрессовые состояния, лимфогранулематоз, период вынашивания ребёнка, язва желудка, острое или хроническое воспаление | Гепатит вирусной природы в острой форме |
| Глобулин альфа-2 | Сахарный диабет, остеомиелит, гломерулонефрит в острой форме, стрессовые состояния, системная красная волчанка, узловатый полиартрит, цирроз | Гипертиреоз, гепатит вирусной природы в острой форме, гемолиз интраваскулярный |
| Бета-глобулин | Сахарный диабет, саркоидоз, ревматоидный артрит, беременность, гломерулонефрит, желтуха подпеченочная, нефротический синдром | Лейкоз, цирроз, склеродермия имеющая системный характер, лимфома, системная красная волчанка |
| Гамма-глобулин | Цирроз, склеродермия системного характера, ревматоидный артрит, лимфолейкоз в хронической форме, муковисцидоз, синдром Шегрена | Лейкоз, склеродермия, гепатит вирусной природы в острой форме, лимфома, гломерулонефрит |
Что может повлиять на результат
На результаты теста играет соблюдение техники забора крови
Исказить показатели, кроме неправильной подготовки к проведению анализа, могут 2 фактора: недавно проведенная процедура гемодиализа, из-за которой произошло разрушение эритроцитов в крови, и повышенный уровень билирубина в организме. В любом из этих случаев потребуется пересдача анализа через некоторое время, которое определит врач.
Источник
Лабораторная работа №8
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ
Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.
Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ
Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.
Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),
Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза
через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.
Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги
Реактивы:
1. Буферный раствор. Можно использовать:
а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;
б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;
в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.
2. Растворы для окраски электрофореграмм:
а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;
б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;
в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO4·7H2O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.
3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:
а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;
б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.
4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:
а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;
б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.
Оборудование:пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.
Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.
Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.
Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B
Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.
Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α1-, α2-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.
Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций
Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.
Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.
Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.
Источник