На каком свойстве ферментов основан метод электрофореза
Главная →
Энзимология
С лечебной целью ферменты вводят различными путями. Для ЛОР-клиники особый интерес представляет введение ферментов физическими методами. Наиболее часто применяется лекарственный электрофорез в постоянном электрическом поле, а также ингаляции аэрозолей.
Метод электрофореза, в котором сочетается действие фермента и небольших дозировок постоянного тока, имеет ряд преимуществ по сравнению с применением ферментных препаратов парентерально. С помощью электрофореза фермент можно вводить непосредственно в ткань патологического участка с нарушенным кровообращением из-за некрозов, инфильтратов, тромбоза сосудов, а также создать более высокие концентрации фермента в пораженном участке при меньших суммарных его дозах. При их введении методом электрофореза обычно не возникает местных и общих аллергических реакций, которые часто наблюдаются при парентеральном введении ферментов, так как последние, являясь для организма чужеродными белками, обладают антигенными свойствами.
Ниже изложены главным образом биохимические обоснования для применения ферментов методом электрофореза. Имеющиеся в руководствах сведения по электрофорезу часто не учитывают физико-химических свойств ферментов — веществ белковой природы, которые очень чувствительны к влиянию рН среды, температуры, ионов тяжелых металлов и другим воздействиям. Поэтому при лечебном применении ферментов методом электрофореза следует учитывать их устойчивость в растворителе, подвижность и полярность, что важно для правильного выбора полюса, с которого будет вводиться фермент.
Для определения полярности необходимо помнить, что ферменты — амфотерные электролиты: в их молекулах имеются свободные карбоксильные группы (-СООН), обладающие кислыми свойствами, благодаря отщеплению ионовводорода, и аминогруппы (-NH2), способные присоединять ионы водорода, приобретая при этом положительный заряд и придавая молекуле фермента щелочные свойства. Степень ионизации этих групп зависит от рН среды: карбоксильные группы полностью диссоциируют в щелочной среде, а аминные — в кислой. Значение рН среды, при котором белковая молекула имеет одинаковое количество положительно и отрицательно заряженных групп, называется ИЭТ. В ИЭТ белки, будучи электронейтральными, неподвижны в электрическом поле постоянного тока. Белки, как и другие лекарственные вещества, могут быть введены методом электрофореза не в молекулярной форме, а в виде ионов. Поэтому электрофорез должен проводиться в растворах с рН, удаленных от ИЭТ вводимого фермента в более кислую или щелочную зону. При этом белок приобретает положительный либо отрицательный заряд. Так, при добавлении водородных ионов (подкисление) подавляется диссоциация карбоксильных групп, белок приобретает катионные свойства и движется к катоду. Подщелачивание среды ведет к диссоциации —NH+ групп, которые превращаются в недиссоциированную форму (—NH2), что приводит к преобладанию в белковой молекуле отрицательно заряженных групп. В этом случае белок находится в форме аниона и передвигается в электрическом поле к аноду. Таким образом, при варьировании рН среды один и тот же фермент можно вводить как с положительного, так и с отрицательного полюса.
ИЭТ белков-ферментов может находиться в кислой, нейтральной, щелочной и даже сильно щелочной среде. ИЭТ трипсина, альфа-химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима, трасилола (ингибитор протеолитических ферментов белковой природы) лежит в щелочной зоне, следовательно, в среде с рН ниже ИЭТ (в частности, рН 7) эти белки являются катионами и должны вводиться с положительного полюса. В более щелочной зоне, чем ИЭТ, они приобретают отрицательный заряд и полюсом их введения становится катод. Ферменты гиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза, у которых ИЭТ находится в кислой среде, при рН 7 заряжаются отрицательно и должны вводиться с катода. При значениях рН среды ниже ИЭТ они будут иметь положительный заряд и поэтому их следует вводить с анода.
Трипсин и альфа-химотрипсин в нейтральной среде (рН 7) обладают свойствами катиона и передвигаются к катоду, причем быстрее мигрирует трипсин, ИЭТ которого по сравнению с альфа-химотрипсином (ИЭТ 8,3-9,1) сдвинута в более щелочную сторону (рН 10,1). При смешивании двух ферментов их электрофоретические свойства не изменяются.
Для ферментного электрофореза важно правильно выбрать растворитель, чтобы рН раствора был отдален от ИЭТ, при этом белковая молекула будет обладать более высокой электрофоретической подвижностью. Например, при введении трипсина с ИЭТ 10,1 в качестве растворителя можно использовать физиологический раствор или еще лучше буферный раствор с рН 4-5. С другой стороны, при выборе растворителя необходимо знать рН стабильности фермента, который часто не соответствует рН-оптимуму действия. Так, точка максимальной устойчивости для трипсина находится при рН 2,3 а для химотрипсина — при рН 3-3,5, а рН-оптимум действия для двух протеиназ лежит при рН 7-8.
При повышении рН среды происходит автолиз этих ферментов, которым особенно выражен при рН свыше 8, при этом белок денатурируется с потерей энзиматической активности.
В предварительных опытах, предшествующих электрофорезу, необходимо также проверить влияние гальванического тока на активность используемого энзима. Кроме того, нужно помнить, что ряд катионов и анионов влияют на биологическую активность ферментов. Например, активность дезоксирибонуклеазы тормозится хлористым натрием, а ионы магния или марганца активируют белковые соединения.
Таким образом, применению электрофореза ферментов должны предшествовать тщательные исследования, включающие установление полярности, выбор растворителя и концентрации фермента.
Важной и нерешенной проблемой электрофореза ферментов является выяснение возможности проникновения белковых молекул с молекулярной массой в тысячи раз большей, чем неорганических ионов, в пораженную ткань через кожу и слизистую оболочку. Лишь при воспалении (повышении сосудистой проницаемости) могут создаваться условия для проникновения ферментов с помощью гальванического тока. Трудную задачу представляет собой количественное определение в тканях вводимых с помощью постоянного тока ферментов, поскольку их концентрация при этом незначительна.
Необходимо учитывать также, что ферменты быстро связываются с белками тканей, которые резко снижают их энзиматическую активность.
Другая новая область энзимофизиотерапии — применение ингибиторов ферментов в отоларингологии. Ингибиторы протеолитических ферментов показаны при тех патологических процессах, в генезе которых лежит активация протеолиза и фибринолиза.
В ЛОР-клинике до настоящего времени практически используется только эпсилон-АКК в качестве препарата, тормозящего процессы фибринолиза, а также как антиаллергическое средство.
Большие перспективы открываются при применении природных ингибиторов, которые в отличие от синтетических обладают более широким спектром действия: они подавляют активность многих протеолитических ферментов, активирующихся при ряде воспалительных и аллергических процессов. В частности, при реакции антиген — антитело освобождаются протеолитические ферменты, которые катализируют образование кининов.
Так как ингибиторы имеют белковоподобную природу, перед введением необходимо выяснить их полярность и электрофоретическую подвижность в различных растворителях. Поскольку выпускаемые препараты содержат примеси других неактивных белковоподобных соединений, которые могут изменять электрофоретические свойства, клиническому применению предшествовали биохимические исследования ингибиторов протеиназ. При растворении ингибиторов в физиологическом растворе (рН 6) пантрипин электрофоретически гетерогенен, он состоит из нескольких фракций, движущихся в сторону как анода, так и катода. Контрикал разделяется при электрофорезе на две катодные фракции; трасилол передвигается к катоду в виде одной фракции. Возникает вопрос, где же находится активная фракция? Предлагается определять специфическую ингибиторную активность во всех фракциях по их способности тормозить активность протеиназ. Опыты показали, что основная часть ингибирующей активности (примерно 90%) содержится в быстрой катодной фракции, в анодной фракции активность ингибитора не обнаружена.
На основании этих опытов можно сделать вывод о том, что ингибитор следует растворять в физиологическом растворе и вводить с положительного полюса.
Ингибиторы можно применять для лечения ряда аллергических и воспалительных заболеваний ЛОР-органов путем назального электрофореза. Учитывая дефицит препаратов ингибиторов, а также необходимость использования больших дозировок при парентеральном введении, в терапии регионарных воспалительных и аллергических процессов более целесообразно и экономически выгодно вводить ингибиторы непосредственно в очаг поражения с помощью постоянного тока (гальванический ток не влияет на активность ингибиторов). Так могут быть созданы более высокие концентрации ингибиторов в пораженных тканях, особенно при повышенной проницаемости слизистых оболочек, наблюдающейся при воспалительных и аллергических реакциях.
Приведенные материалы показывают, что успех ферментной физиотерапии в существенной мере зависит от знания физико-химических свойств используемых энзимов, а также возможности проникновения экзогенных ферментов в очаг поражения, длительности их пребывания и выведения их организма. Здесь еще много неясных вопросов, которые могут быть разрешены клиницистами совместно с физиотерапевтами, биохимиками, фармакологами, физиологами. Необходимо внедрение новых методов количественного определения ферментов в тканях, включая применение флюорохромированных ферментов, флюорохромированных антител, а также радиоактивных индикаторов для прослеживания вхождения ферментов в клетки и определения их активности в пораженных тканях.
Среди физических методов терапии ферментами ЛОР-заболеваний наряду с электрофорезом важное значение имеет введение энзимов и их ингибиторов с помощью ингаляций их аэрозолей. Использование ферментов путем ингаляций аэрозолей основано на том, что они могут непосредственно взаимодействовать со специфическими субстратами очага повреждения и вызывать их расщепление.
Методы электрофореза и ингаляций аэрозолей ферментов нашли применение в терапии заболеваний ЛОР-органов — ларингитов, ринитов, воспалений полости рта и глотки, стенозирующих ларинготрахеитов, бронхитов у детей и т.д.
Источник
Электрофоре́з белко́в — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки, основанный на движении заряженных белковых макромолекул различного молекулярного веса в стационарном электрическом поле. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли[en][2][3].
Варианты метода электрофореза белков[править | править код]
Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии и молекулярной биологии) в различных областях[3]:
- Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)
- Электрофорез с подвижной границей
- Зональный электрофорез без поддерживающей среды
- Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой
- Электрофроез белков в крахмальном геле[4]
- Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)[5]
- Электрофорез белков в агарозном геле
- Электрофорез на фильтровальной бумаге
- Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране
- Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды
- Капиллярный электрофорез
Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D) электрофорез[6], препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков[en] и электрофорез в присутствии детергента (в денатурирующих условиях). Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.
В зависимости от конструкции электрофоретического аппарата различают горизонтальный и вертикальный электрофорез белков.
История и области применения[править | править код]
После первых экспериментов с электрофорезом, проводившихся в нескольких лабораториях в 1930-е — 1940-е годы, в том числе пионером электрофореза — нобелевским лауреатом Арне Тиселиусом[7], существенный прогресс в дальнейшем развитии и применении этого метода для разделения белков начался в 1955 году с разработки зонального электрофореза в крахмальном геле, которую осуществил Оливер Смитис, впоследствии также нобелевский лауреат[4][8]. Метод совершенствовался[9][10] и получил большое распространение в экспериментальной биохимии и молекулярной биологии.
В 1959 году был предложен метод электрофореза белков в ПААГ[5], в 1962 году — метод диск-электрофореза[11], в 1969 году — применение денатурирующих агентов (SDS)[12]. В 1970 году Лэммли значительно усовершенствовал электрофорез в ПААГ, разделив 28 белковых компонентов бактериофага T4[2]. В 1975 году появился двумерный (2D) электрофорез[6].
Электрофорез белков нашёл широкое применение в биологических исследованиях, как фундаментальных[2][4][13], так и прикладных[14][15][16][17][18]. Ряд вариантов метода используется и поныне; например, 2D-электрофорез является в протеомике одним из методов изучения протеома[19].
См. также[править | править код]
- Протеом
- Электрофорез
- Электрофорез белков в полиакриламидном геле
- Электрофорез в полиакриламидном геле
Примечания[править | править код]
- ↑ Schägger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa (англ.) // Analytical Biochemistry : журнал. — Orlando, FL, USA: Academic Press, 1987. — Vol. 166, no. 2. — P. 368—379. — ISSN 0003-2697. — PMID 2449095. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 6 апреля 2018 года.
- ↑ 1 2 3 Laemmli U. K.. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 (англ.) // Nature : журнал. — London, UK: Nature Publishing Group, 1970. — Vol. 227, no. 5259. — P. 680—685. — ISSN 1476-4687. — doi:10.1038/227680a0. — PMID 5432063. Архивировано 27 февраля 2015 года. (Проверено 27 февраля 2015)
- ↑ 1 2 Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). — М.: Наука, 1981. — 288 с.
- ↑ 1 2 3 Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults (англ.) // The Biochemical Journal : журнал. — London, UK: Biochemical Society; Portland Press, 1955. — Vol. 61, no. 4. — P. 629—641. — ISSN 0264-6021. — PMID 13276348. Архивировано 27 февраля 2015 года. (Проверено 27 февраля 2015)
- ↑ 1 2 Raymond S., Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis (англ.) // Science : журнал. — Washington, D.C., USA: American Association for the Advancement of Science, 1959. — Vol. 130, no. 3377. — P. 711. — ISSN 0036-8075. — PMID 14436634. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 6 октября 2017 года.
- ↑ 1 2 O’Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins (англ.) // The Journal of Biological Chemistry : журнал. — Baltimore, MD, USA: American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1975. — Vol. 250, no. 10. — P. 4007—4021. — ISSN 4406-4412. — PMID 236308. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 18 января 2020 года.
- ↑ Tiselius A. A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures (англ.) // Transactions of the Faraday Society : журнал. — London, UK: Faraday Society, 1937. — Vol. 33. — P. 524—531. — ISSN 0014-7672. — doi:10.1039/TF9373300524. (Проверено 28 февраля 2015) Архивировано 10 августа 2020 года.
- ↑ Electrophoresis: Theory, Methods and Applications / Ed. by M. Bier. — 3rd printing edn. — New York, NY, USA: Academic Press, 1964. — P. 225. — 563 p. (англ.) (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 5 октября 2017 года.
- ↑ Smithies O. An improved procedure for starch-gel electrophoresis: further variations in the serum proteins of normal individuals (англ.) // The Biochemical Journal : журнал. — London, UK: Biochemical Society; Portland Press, 1959. — Vol. 71, no. 3. — P. 585—587. — ISSN 0264-6021. — PMID 13638269. Архивировано 27 февраля 2015 года. (Проверено 27 февраля 2015)
- ↑ Gahne B. Studies on the inheritance of electrophoretic forms of transferrins, albumins, prealbumins and plasma esterases of horses (англ.) // Genetics : журнал. — Baltimore, MD, USA: Genetics Society of America, 1966. — Vol. 53, no. 4. — P. 681—694. — ISSN 0016-6731. — PMID 5960258. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 5 октября 2017 года.
- ↑ Ornstein L., Davis B. J. Disc Electrophoresis. — Rochester, NY, USA: Distillation Products Industries, Eastman Kodak Co., 1962. (англ.)
- ↑ Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (англ.) // The Journal of Biological Chemistry : журнал. — Baltimore, MD, USA: American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1969. — Vol. 244, no. 16. — P. 4406—4412. — ISSN 0021-9258. — PMID 5806584. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 18 января 2020 года.
- ↑ Hunter R. L., Merkert C. L. Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels // Science. — 1957. — Vol. 125. — P. 1294—1295. (англ.)
- ↑ Baker C. M. A. Molecular genetics of avian proteins. IX. Interspecific and intraspecific variation of egg white proteins of the genus Gallus (англ.) // Genetics : журнал. — Baltimore, MD, USA: Genetics Society of America, 1968. — Vol. 58, no. 2. — P. 211—226. — ISSN 0016-6731. — PMID 5960258. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 6 октября 2017 года.
- ↑ Baker C. M. A., Croizier G., Stratil A., Manwell C. Identity and nomenclature of some protein polymorphisms of chicken eggs and sera (англ.) // Advances in Genetics : журнал. — New York, NY, USA: Academic Press, 1970. — Vol. 15. — P. 147—174. — ISSN 0065-2660. — PMID 4936422. (Проверено 27 февраля 2015) Архивировано 13 октября 2020 года.
- ↑ Romanov M. N. (1988-06-07). “Study of genetic polymorphism of ovoproteins in some egg type and meat-egg type lines of chickens” in 4th Symposium of Young Poultry Scientists. Abstracts: 10, Kraków, Poland: World’s Poultry Science Association, Polish Branch. OCLC 899128291. Проверено 2015-02-28. (англ.) Архивировано 6 октября 2017 года.
- ↑ Романов М. Н. (1994-01-27). “Электрофоретическое изучение овопротеиновых локусов в популяциях яичных кур в процессе совершенствования кросса «Хайсекс коричневый»” in I Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животных, Киев, 27—29 января 1994. Тез. докл.: 34—35, Киев, Украина: Укр. акад. аграр. наук, Ин-т разведения и генетики животных, Ин-т агроэкологии и биотехнологии; Аграрна наука. ЦНСХБ, TRN: RU9815007X. OCLC 899128337. Проверено 2015-02-28. Архивировано 6 октября 2017 года.
- ↑ Романов М. Н.; Черников В. Ф. (1994-01-27). “Полиморфные овобелки как маркеры внутрипопуляционной изменчивости озёрной чайки” in I Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животных, Киев, 27—29 января 1994. Тез. докл.: 35—36, Киев, Украина: Укр. акад. аграр. наук, Ин-т разведения и генетики животных, Ин-т агроэкологии и биотехнологии; Аграрна наука. OCLC 899128260. Проверено 2015-02-28. Архивировано 8 августа 2020 года.
- ↑ Komatsu S., Kojima K., Suzuki K., Ozaki K., Higo K. Rice Proteome Database based on two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: its status in 2003 (англ.) // Nucleic Acids Research : журнал. — Oxford, UK: Oxford University Press, 2004. — Vol. 32, no. Database issue. — P. D388—D392. — ISSN 0305-1048. — PMID 14681440. (Проверено 28 февраля 2015) Архивировано 3 июня 2018 года.
Литература[править | править код]
- Vesterberg O. History of electrophoretic methods // Journal of Chromatography. — 1989. — Vol. 480. — P. 3—19. (англ.)
Ссылки[править | править код]
- Allozyme Electrophoresis Techniques (англ.) (недоступная ссылка). Fishing: Research: Gene Conservation Lab. Division of Commercial Fisheries, Alaska Department of Fish and Game, State of Alaska. — Пособие по электрофорезу в крахмальном геле. Дата обращения 27 февраля 2015. Архивировано 27 февраля 2015 года.
Источник
Электрофорез
Термином «электрофорез» описывается
процесс разделения ферментов на основе дифференциальной их миграции в
электрическом поле. При проведении лабораторных работ в области аналитической
биохимии электрофорез представляет собой метод, обеспечивающий высшую степень
разделения ферментов на принципах физико-химической сепарации. Поэтому
указанный метод изучался прежде всего с точки зрения препаративной сепарации.
Именно для такого предназначения создано несколько специальных приборов. Однако
необходимо иметь в виду, что на электрофоретическую подвижность ферментов
решающим образом влияет ряд факторов; они могут быть ответственными за
разочаровывающие результаты. Во-первых, электрофоретическая подвижность
макромолекул низка, вследствие чего соответствующая операция разделения характеризуется
малой скоростью и диффузия будет приводить к размыванию концентрационных зон, а
ферменты — смешиваться с медленно движущимися продуктами электролиза.
Подвижность молекул варьирует в обратном отношении к вязкости среды. Если отвод
тепла от различных участков поперечного сечения сепарационной камеры происходит
с разной интенсивностью, то подвижность молекул по поперечному сечению будет
варьировать. Это обусловлено вариациями температуры по поперечному сечению и
зависимостью вязкости от температуры. Наличие твердой фазы, хотя она сама по
себе и не важна как объект для выделения, контролирует конвекционные возмущения
потоков в сепарационной камере и вызывает гравитационные разрушения уплотненных
зон. Твердая фаза также уменьшает подвижность молекул. Эти и другие проблемы
осложняют применение методов перепаративного электрофореза. Капитальные
затраты, относящиеся особенно к оформлению процессов охлаждения сепарационной
камеры, удалению из нее продуктов электролиза и обеспечению безопасности
эксплуатации, довольно высоки. Электрофорез может играть определенную роль
только в процессах крупномасштабного выделения некоторых ферментов, особенно
при сепарации ферментационных мультисубъединиц, которые подвержены разрушению в
присутствии твердой фазы и требуются при хроматографии.
Зональное ультрацентрифугирование
Центрифугирование при очень высоких
частотах вращения было рассмотрено ранее применительно к сепарации твердой и
жидкой фаз.
Однако первоначально намечалось как
метод высокоразделяющей сепарации частиц, находящихся в растворе. При
использовании для целей дифференциальной миграции ротор ультрацентрифуги
заполнялся жидкостью определенной плотности, и к оси ротора таким образом
добавлялась некоторая кольцевая зона. Эта зона подвергалась воздействию
центробежных сил, что заставляло частицы различной плотности мигрировать из нее
наружу с различными скоростями. Метод приобрел большое значение при очистке
вирусов, которые по своей величине, в общем, на один порядок крупнее молекул
ферментов. Гравитационные поля, требующиеся для разделения молекул ферментов,
слишком велики. Поэтому в настоящее время очевидно, что использование метода
будет и впредь ограничиваться экстремально крупными ферментативными
комплексами. Кроме того, даже при использовании наиболее подходящих по величине
роторов эффективная вместимость, центрифуг незначительна. Как и в случае
электрофореза, метод зонального ультрацентрифугирования имеет то преимущество,
что он не связан с наличием в жидкости твердой фазы. Однако присутствующие в растворе
химические вещества, создающие градиент плотности, могут повреждать структуру
комплексов ферментов.
Отделочные операции
Общепринято к отделочным операциям
относить такие, как стерилизация продукта, уменьшение его размеров в товарном
виде, таблетирование и составление рецептур, а также обессиливание ферментов,
их концентрирование, высушивание, хранение на складе и контроль чистоты. Хотя
эти установленные конечные, или отделочные операции предшествуют
непосредственному выпуску препаратов в продажу, они могут в ряде случаев иметь
даже более важное значение, чем собственно операции очистки ферментов. Во
всяком случае, для внеклеточных ферментов дело обстоит именно так. Для ряда
практических применений внутриклеточных ферментов фракционирование требуется
лишь для того, чтобы избавиться от некоторых контаминантов. Остальные
требования определяются исключительно стремлением придать выпускаемому продукту
надлежащую форму и внешний вид и необходимостью точной и воспроизводимой их
специфичности. Большинство отделочных операций — это скорее обобщение
результатов практических традиционных приемов работ внутри той пли иной
компании, чем воплощенный в натуре итог исследований. Исследовательские
учреждения обычно не интересует такое свойство продукта, как сохраняемость; их
критерий чистоты часто отличается от критерия, каким руководствуется
изготовитель.
Обессоливание
Многие ферментные препараты нуждаются
в освобождении от неорганических солей, которые придают продуктам неприятный
запах и нежелательны в клиническом отношении. Обессоливание ферментных
препаратов может также играть важную роль как промежуточная стадия в
технологическом процессе выделения химически чистых ферментов. В частности, эта
стадия предшествует очистке ферментов с помощью ионообменной абсорбции. Термин
«обессоливание» также широко применяется для описания процессов удаления любых
низкомолекулярных соединений из ферментных препаратов с помощью операций,
которые не учитывают различий между ионами и незаряженными низкомолекулярными
соединениями.
Классический метод удаления из
препаратов мелких ионов с использованием смешанной ионообменной насадки был
применен к очистке некоторых наиболее устойчивых ферментов. Это применение
основывается на наличии у гидрофобных углеводородно-основных ионообменников пор
весьма малого размера. Такие ионообменники имеют очень низкую емкость по
макромолекулам, но высокую емкость по ионам. Посредством применения смешанной
насадки из катионных и анионных ионообменных смол становится возможным удалить
из обрабатываемых препаратов как положительно, так и отрицательно заряженные
ионы. К сожалению, гидрофобная природа указанных ионообменников и формирование
на их поверхностях мощных зарядов приводят к возможности денатурации
обрабатываемых ферментов. Данный метод имеет значительную конкуренцию со
стороны второго хроматографического метода — метода гельфильтрации, который был
описан выше. Возможности этого метода для осуществления, в промышленных
масштабах операций удаления из ферментных препаратов различных ионов или мелких
молекул доказаны вполне надежно. При этом неизбежно разбавление препаратов. В
процесс вовлекаются только две фракции, а поскольку гельфильтрация не
предполагает использования специфических сорбционных участков насадки, она
может проводиться при высокой загрузке колонки, что ограничивает степень
разбавления. Серьезно осложняет разделение ферментных препаратов высокая
вязкость соответствующих растворов; не меньшую проблему составляет засорение
геля белковыми материалами. Однако применение Сефадекса, который представляет
собой декстран G-25 с поперечными связями, снимает последнюю проблему, так как он
выдерживает очистку с помощью раствора гидроокиси натрия.
При удалении из ферментных препаратов
всех низкомолекулярных соединений важную роль играют два мембранных метода —
диализ и ультрафильтрация. Обычно ультрафильтрация будет позволять удалять
низкомолекулярные соединения по существу с той же скоростью, как и воду.
Обеспечив подпитку воды в ультрафильтрационную камеру, можно добиться
достаточно эффективного удаления из системы и других молекул, помимо молекул
воды. «Диафильтрация» обычно осуществляется при разбавлении на первой стадии
препарата до необходимого уровня с тем, чтобы снизить до минимума
концентрационную поляризацию.
Теоретически ультрафильтрация
превосходит по своим возможностям диализ, так как ее реализация не требует
преодоления предельной концентрации соли на фильтрующей стороне мембраны.
Однако концентрация соли при диализе может поддерживаться на низком уровне
благодаря быстрому пропусканию воды через фильтрующую сторону мембраны. Для
этой цели может оказаться полезным применение деионизированной воды,
позволяющее предотвратить контаминацию мембраны металлическими солями при
промывке ее противотоком.
Серьезные ограничения, которые могли
бы налагаться на процессы ультрафильтрации концентрационной поляризацией, в
случае очистки диализом не выявлены, хотя это явление не теряет своей
значимости с точки зрения достижения эффективного перемешивания потока
продукта.
Фирмы, выпускающие оболочки для колбасных
изделий,” в качестве вторичных продуктов производят также трубки для
диализа. При этом в процессе производства соответствующих мембран в них
неизбежно остается определенное количество металлических ионов и соединений,
содержащих серу. Металлические ионы могут вызывать денатурацию обрабатываемых
ферментов. Поэтому мембраны перед их применением подвергаются обычно кипячению
в несколько раз сменяемых порциях воды, куда может добавляться
этилендиаминтетрауксусная кислота.
В результате исследований процесса
ультрафильтрации разработано новое поколение микротрубчатых диализирующих
мембран. Мембраны образуются из большого количества микротрубок, заделываемых
вместе в так называемый модуль с общим входом и общим выходом. Соотношение
площади поверхности модуля и его объема является очень высоким. Конструкция
оказалась весьма эффективной, если не считать подверженности ее забиванию
нерастворимыми твердыми веществами. Кроме того, изготовление модулей обходится
довольно дешево. Есть основания надеяться, что высокая эффективность
диализирующих мембран подобного рода и их модульная форма вновь пробудят
интерес к практическому применению процессов диализа.
Подобно ультрафильтрации, диализ
может привести к значительной утрате активности фермента, однако маловероятно,
что эта утрата обязана наличию срезающих усилий. Скорее всего инактивация
фермента при диализе происходит из-за наличия в мембранах каких-то
контаминантов или межфазных границ, локально ограничивающих поток материала.
Концентрирование
Концентрирование — одна из основных
стадий технологического процесса выделения внеклеточных ферментов. Как
отделочная операция концентрирование обычно осуществляется методами сушки. При
выделении внутриклеточных ферментов часто оказывается необходимым
сконцентрировать жидкость во время промежуточной стадии очистки, поскольку
высокая разделяющая способность соответствующих методов может приводить к
избыточному разведению продукта. При низких уровнях содержания белка последний
имеет выраженную тенденцию к покрытию рабочей поверхности плотным слоем.
Твердые фазы, применяемые в хроматографии, обладают особенно большой площадью
поверхности.
При концентрировании ферментов может
применяться оборудование, обеспечивающее испарение влаги из материала при
пониженных температурах, как это уже сделано применительно к технологии
производства фруктовых соков могут быть использованы методы полного осаждения
или полной адсорбции. Для изоляции внутриклеточных ферментов разумное
применение соответствующей стадии обработки в определенные моменты процесса
многостадийной очистки может в ряде случаев позволить исключить необходимость
проведения собственно стадии концентрирования, которая по своей сути должна
рассматриваться как непроизводительная. Такое построение процесса особенно
важно в промышленных условиях, где концентрирование обходится довольно дорого,
протекает медленно и может часто приводить к денатурации больших количеств
продукта.
Сушка
Для сушки ферментов могут с успехом
применяться промышленные методы, разработанные применительно к получению
” пищевых и фармацевтических продуктов. Как и в случае других биологических
материалов, наиболее устойчивые ферменты могут быть высушены в распылительных
сушилках или тепловым способом под вакуумом; менее стойкие требуют сушки в за
мороженном состоянии (сублимационная сушка).
Большинство внутриклеточных
ферментов, поступающих в продажу от специализированных компаний в высушенном
состоянии, производится методом сублимационной сушки. И, как правило, всегда
велик соблазн, приняв, что все внутриклеточные ферменты являются в высшей
степени лабильными, ориентироваться на их сушку толь ко сублимацией. Однако
истинное положение дел требует не принимать подобного опрометчивого решения без
предварительного испытания более дешевых и простых способов сушки.
Для получения сухих препаратов
внеклеточных ферментов широко применяется распылительная сушка. Достигаемая при
этом степень концентрации ферментов приводится ниже, при обсуждении результатов
и подобных продуктов. Классические выпарные аппараты корпусного или трубчатого
типов или типа падающей пленки для концентрирования ферментов находят
ограниченное применение из-за трудностей контроля пенообразования и обрастания
рабочих поверхностей осадком. Могут быть применены пластинчатые теплообменники.
Выпарную установку лучше всего нагревать горячей водой под высоким давлением.
Концентрирование жидкости осуществляется непосредственно из системы,
находящейся в слое паров, по мере его расширения с большой скоростью.
Подвергаемые обработке растворы ферментов должны иметь гомогенную консистенцию,
быть хорошо отфильтрованными и свободными от воздуха и крупных инородных
частиц. Для предотвращения кавитации следует применять насосы вытесняющего
действия. Температура должна поддерживаться на уровне 40 °С или даже ниже. При
типичном процессе растворы ферментов обычно концентрируются в две стадии: от 8
или 12 % содержания твердых веществ до 35%, а затем — до 65%.
В настоящее время основным
применением ультрафильтрации является концентрирование, так как
концентрационная поляризация существенно препятствует осуществлению многих
процессов фракционирования с использованием этого метода, хотя в случае
осветленных культуральных жидкостей он позволяет удалить из препарата большую
долю низкомолекулярных составных частей. (Уровень сконцентрированного белка во
внеклеточной культуральной жидкости будет обычно невысоким, вследствие чего
поляризация будет носить ограниченный характер.) Представляется, что подобное
применение ультрафильтрации будет быстро прогрессировать и расширяться по мере
того, как будет возрастать надежность информации о свойствах системы, которая
подлежит обработке.
Наиболее важными операциями
концентрирования являются те, которые определяются как фракционирование. В
частности, операции осаждения или преципитации и адсорбции служат одновременно
и операциями концентрирования. Для выделения целевых продуктов из нативных
внеклеточных ферментов пли из нативных внутриклеточных ферментных препаратов реальных
процессов выделения соответствующих препаратов.
Бактериальная а-амилаза была получена
в сухом состоянии на вакуумной сушильной установке. При этом из 5000 л
фильтрата культуральной жидкости, подвергнутого фракционированию спиртом, за 8
ч работы было получено 73,5 кг продукта. При промышленном производстве
аспарогеназы сублимационным методом было получено несколько килограммов
готового продукта. Для сушки ферментных препаратов сублимацией весьма важно
обеспечить максимально полное удаление влаги из обрабатываемого материала.
Источник