Оценка каких свойств микроорганизмов проводится
Культуральные свойства бактерий
К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.
Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.
Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.
При описании колоний учитывают следующие признаки:
1) форму колонии – округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;
2) размер (диаметр) колонии – очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);
3) поверхность колонии – гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;
4) профиль колонии – плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;
5) прозрачность – тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;
6) цвет колонии (пигмент) – бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;
7) край колонии – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;
8) структуру колонии – однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;
9) консистенцию колонии; определяют прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).
Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.
Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.
Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды и температуры культивирования.
Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя четырех-семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях.
В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.
При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.
Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.
Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.
В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бактериям – фотобактериям -относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).
Выделение чистых культур микроорганизмов
Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий -обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной практике, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и в целом при любой работе с микроорганизмами.
Исследуемый материал (вода, почва, воздух, пищевые продукты или другие объекты) обычно содержит ассоциации микробов.
Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, т. е. производится его идентификация.
Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп:
1. Метод Пастера – последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).
2. Метод Коха («пластинчатые разводки») – последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и в дальнейшем при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.
3. Метод Шукевича – применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу, на месте посева. Пересевая верхние края культуры, можно получить чистую культуру.
4. Метод Дригальского – широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках.
С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 суток выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.
5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 оС агаризированной питательной среде.
Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды.
Для извлечения изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
6. Метод Хангейта. Когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку; среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.
7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.
Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик
Опубликовал Константин Моканов
Источник
Микробиология – обширная современная наука, изучающая биохимические и физические свойства, морфологию и систематику бактерий. Мир прокариот богат огромным количеством различных видов. Чтобы исследовать все параметры этих микроорганизмов, ведется работа с их культурами на специальных питательных средах в стерильных условиях. Культуральные свойства бактерий – это один из важнейших способов определения и изучения прокариот.
Что такое колония бактерий?
Не секрет, что прокариоты – это одноклеточные организмы. Они легко и быстро размножаются, удваивая свое количество, по некоторым данным, каждые 20-30 минут. Несложно догадаться, что перед нами геометрическая прогрессия роста культуры.
Колония – это потомство одной клетки, видимое скопление огромного количества микроорганизмов на питательной среде. По размеру колонии, ее цвету и другим морфологическим признакам в лаборатории определяют культуральные свойства бактерий.
Для изучения параметров отдельного скопления клеток прокариот используется специальная питательная среда. На ней микроорганизмы способны быстро размножаться, т. к. в состав входят важные для метаболизма бактерий вещества. В итоге через 4-5 суток (промежуток времени может варьировать) на чашке Петри появляются приметные видимые точки, с которыми и проводится работа.
Проба бактерий, полученная из какой-либо среды, предварительно разбавляется для уменьшения количества бактерий на единицу объема. Проводится эта процедура для комфортной работы в дальнейшем, т. к. при чрезмерном посеве микроорганизмов питательная среда может покрыться сплошным слоем колоний (так называемый «газон»). Тогда отдельные точки едва различимы, а многие процедуры становятся невозможными для проведения.
Понятие культуральные свойства бактерий
Каким образом проводится анализ колоний микроорганизмов? Какие параметры следует учесть при исследовании?
Характеристика колонии бактерий на питательной среде составляется по нескольким критериям. К ним относятся морфологические, биохимические, физиологические свойства микроорганизмов, и все эти параметры определяются в лаборатории поэтапно. Например, визуальные отличия колоний данной бактерии можно зарегистрировать сразу после их выращивания. Остальные признаки изучаются уже при помощи специального оборудования (микроскоп) или определенных методик работы с веществами-анализаторами метаболитов, пигментов, ферментов и других продуктов жизнедеятельности прокариот.
Некоторые культуральные свойства бактерий приведены ниже.
1. Размеры колонии. Она может быть очень мелкой, мелкой, средней и большой. Диаметр измеряется в миллиметрах и может находиться в диапазоне от 0,1 до 5 и более. Колонии, не превышающие 1 мм в диаметре, называются точечными.
2. Цвет, а также способность к выделению красящего пигмента в окружающую среду.
3.Поверхность. Здесь определяют, является ли она гладкой, шероховатой, бугристой или же вовсе складчатой.
4. Профиль колонии: кратерообразная, выпуклая, конусовидный или просто плоский.
5. Структура колонии. Она может быть однородной, струйчатой, крупнозернистой или мелкозернистой.
6. Оптические свойства: прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, флуоресцирующая, матовая или блестящая;
7. Консистенция. Колония может быть вязкой или жидкой, тестообразной или пленчатой, маслянистой или хрупкой.
8.Край колонии: ровный, лопастной, ризоидный, волнистый, зубчатый и т. д.
Если работа ведется с мелкими группами клеток, используется микроскоп. При небольшом увеличении можно разглядеть и край колонии, и ее профиль, и поверхность. Некоторые признаки исследуются с помощью химических веществ. Консистенцию можно узнать, дотронувшись стерилизованной петлей или пипеткой до колонии. Таким образом определяются культуральные и биохимические свойства бактерий.
Питательная среда
Для того чтобы бактерии активно размножались в лабораторных условиях, используются питательные среды. Они могут быть растительного или животного происхождения, а по консистенции – твердые или жидкие. Важными параметрами при изготовлении таких смесей является постоянная кислотность, осмотическое давление и, конечно же, наличие ферментов, витаминов, микро- и макроэлементов. Не стоит забывать и об источниках углерода, азота и водорода.
Питательная среда обязательно должна быть прозрачной или полупрозрачной, чтобы была возможность без ошибок определить культуральные свойства бактерий. Агар чаще всего используется как исходный материал для изготовления таких сред. Он может быть в жидком (расплавленном) состоянии, но преимущественно уже сразу заливается в чашке Петри и застывает.
Жидкие питательные среды тоже используются в лабораторных условиях, но, в связи с агрегатным состоянием физиология микроорганизмов, культуральные свойства бактерий изучаются немного по-другому. Здесь важны такие параметры, как степень мутности воды, поверхностный, пристеночный или же придонный рост. Зернистый осадок, однородный или же в виде хлопьев, и другие признаки, которые возможно наблюдать только в жидкостной среде.
Инструменты для работы
Манипуляции с бактериальными клетками требуют использования стерилизованных лабораторных инструментов. Посев и изучение культуральных свойств микроорганизмов требует наличия бактериальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть стерилизованы в пламени спиртовки, а наконечник пипетки предварительно отколот.
Эти нехитрые приспособления помогут при работе с посевами в лаборатории как на твердой питательной среде, так и в жидкой.
3 этапа выделения изолированных колоний
Исходный материал, как правило, содержит смесь разнообразных бактерий. Выделение изолированных колоний необходимой группы клеток – это скрупулезный и требующий внимания процесс. Он условно делится на три этапа:
1. Выделение накопительной культуры бактерий, среди которых присутствует необходимая нам для исследования.
2. Выделение изолированных чистых колоний с помощью специальных селективных методов.
3. Выращивание и размножение клеток бактерий, проведение работы с ними.
Конечно, для «добычи» нужных бактерий следует искать места их наибольшей концентрации во внешней среде, а в случае патогенных или условно-патогенных прокариот можно вовсе использовать биологический метод исследования. Суть последнего заключается в том, что подбирается организм, который чувствителен к данной бактерии. Та размножается в подопытном животном, и в результате в пробе крови можно найти множество необходимых для работы клеток прокариот.
Выделение изолированных колоний
Культуральные свойства бактерий можно исследовать только у изолированных и чистых колоний. Чтобы получить таковые из нескольких десятков посторонних видов бактерий на чашке Петри, используют метод Коха. Его суть заключается в том, что на 3 разные и свободные от микроорганизмов чашки с питательной средой помещают нужных бактерий. Причем это делают одной и той же петлей или пипеткой по остаточному принципу, т. е. не соскребают дополнительно клетки бактерий после проведения по питательной среде первой и второй чашки. Так, уже на третьей количество бактерий уменьшится и можно будет спокойно найти нужную колонию для исследования.
Культуральные свойства – основы микробиологии
Изучение клеток бактерий всегда начинается с анализа их колонии. По определенному списку параметров описывается группа микроорганизмов на чашке Петри, а затем уже делается фиксированный мазок и готовится таким образом препарат. Его рассматривают с помощью микроскопа и уже описывают отдельные клетки колонии. Оба действия нужны для идентификации бактерий: патогенные они или нет, к какой систематической группе относятся и т. д.
Где можно обнаружить бактерий?
Практически везде. Они обитают и в воздухе, и в земной коре, и в воде, и в таких экстремальных условиях, как гейзеры, вулканы или, наоборот, арктические ледники. Миллиарды бактерий находятся и в нашем человеческом организме, и среди них присутствуют как полезные, так и патогенные виды.
Мазок с любой поверхности, если она не была предварительно стерилизована, на чашке Петри даст несколько различных видов колоний. Прорастет клетка бактерий или нет, зависит от состава питательного субстрата, что часто используется при выращивании необходимых микроорганизмов. Так, заранее готовится избирательная среда, на которой могут проживать только определенные виды бактерий.
Для систематизации или идентификации активно используются культуральные свойства бактерий. Микробиология часто встречается с такими проблемами, как высев и рост колоний, их выборка, стерилизация оборудования и скрупулезная работа над пламенем спиртовки.
Заключение
Во многих биологических лабораториях проводится исследование бактериальных клеток различного происхождения. Это и диагностические центры, и научные объединения. Культуральные свойства бактерий – это один из способов определения микроорганизмов, что помогает при работе с «коктейлями» из различных видов прокариот. Также знание о том, к какой систематической группе относится та или иная клетка, позволяет лишний раз проверить правильность хода исследования используемого материала.
Источник